UNIDAD DE CITOMETRÍA DE FLUJO Y SEPARACIÓN CELULAR
El principio en el que se basa esta tecnología es hacer pasar células u otras partículas en suspensión alineadas dentro de un flujo laminar a través de una cámara de flujo sobre la que incide un haz de luz coherente a una longitud de onda específica. La medida de las características ópticas de cada célula está relacionada con la dispersión de la luz y con la emisión de fluorescencia de las células al ser excitadas por el rayo luminoso. El empleo de fluorocromos con longitudes de excitación compatibles con las fuentes de luz del citómetro y con sus diferentes espectros de emisión posibilita el estudio simultáneo de diferentes parámetros biológicos, características funcionales y fenotípicas de cada una de las células consideradas individualmente incluso en muestras heterogéneas.
El desarrollo tecnológico implementado hoy en día en citómetros de flujo con alta capacidad operativa permite que este método analítico tenga gran aplicabilidad tanto en investigación básica, en investigación clínica así como en el diagnóstico clínico.
La Unidad de Citometría de Flujo y Separación Celular del IDIPHIM tiene como objetivos:
- Ofrecer apoyo técnico y asesoramiento a los grupos de investigación del centro o a investigadores visitantes en el diseño de experimentos, selección de marcadores, adquisición de muestras y análisis de poblaciones celulares y discusión de los resultados obtenidos.
- Aislamiento de poblaciones celulares mediante tecnología de “Cell Sorting”.
- Desarrollo de nuevas tecnologías y evaluación de nuevos equipos.
- Organización de cursos de formación en esta tecnología para usuarios.
La Unidad de Citometría de Flujo y Separación Celular del Instituto de Investigación Sanitaria Puerta de Hierro está dotada con equipamiento científico de primer nivel destinado a investigación y adecuado para la realización de todas sus funciones como Unidad de Apoyo a investigadores internos como investigadores externos.
La Unidad de Citometría de Flujo y Separación Celular tiene a disposición de los usuarios un CITÓMETRO DE FLUJO ANALIZADOR CON 4 LÁSERES DE ALTO RENDIMIENTO (BD) para la detección de 19 parámetros simultáneamente (16 de fluorescencia y 3 de dispersión de luz) financiado dentro del Subprograma Estatal de Infraestructuras y Equipamiento Científico-Técnico de la Acción Estratégica en Salud 2021-2023, con cargo a los fondos europeos del Plan de Recuperación, Transformación y Resiliencia. (IFEQ22/00172). |
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Separador celular digital de alta velocidad FACSAria II (BD) capaz de separar hasta cuatro poblaciones celulares fenotípicamente diferentes al mismo tiempo tanto en condiciones estériles como no estériles. Consta de 2 láseres de 488nm y 633nm y posibilidad de detección de 7 parámetros de fluorescencia además de los parámetros relativos a tamaño (FSC) y complejidad celular (SSC). |
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El equipo AUTOMACS PRO (Miltenyi-Biotec) permite el aislamiento de poblaciones celulares a partir de muestras biológicas por métodos inmunomagnéticos. El sistema AUTOMACS PRO posibilita el procesamiento de hasta 6 muestras a la vez con diferentes procedimientos de selección, previa programación encada una de ellas de forma automatizada. |
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La Unidad de Citometría de Flujo y Separación Celular tiene a disposición de los usuarios un citómetro más, cedido por el Servicio de Inmunología. Es el citómetro de flujo FC500 (Beckman Coulter), con una configuración óptica de un láser azul (488nm) y 5 detectores de fluorescencia lo que ofrece el desarrollo de estudios de biología celular. |
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La Unidad de Citometria De Flujo cuenta con un citometro de flujo analizador digital MACSQUANT (MILTENYI-BIOTEC) equipado con tres láseres de estado sólido refrigerados por aire y alineamiento fijo: laser violeta de 405nm, azul de 488nm. y rojo de 635 nm . Permite la detección simultánea de 10 parámetros (con 8 canales ópticos para medidas de fluorescencias y 2 detectores para parámetros físicos de tamaño (FSC) y complejidad celular (SSC). La compensación de fluorescencias se realiza mediante sistema de matriz 8×8 inter e intra -láseres con recálculo automático tras ajustes de voltajes. |
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- PROGRAMAS DE ANÁLISIS DE DATOS
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- Software FACSDiva (BD): permite la adquisición de datos en el separador celular FACSAria II y su posterior análisis, diagramas con posibilidad de escalas lineal, logarítmica y biexponencial y exportar datos estadísticas y plantillas.
- Software MACSQuantify (Miltenyi Biotec): bajo sistema operativo Windows con todas las funciones para representar datos con análisis de imágenes y estadística con posibilidad de análisis de datos durante la adquisición de muestras, agrupamiento de datos y generación de un único fichero. Plantillas de análisis personalizadas.
- Software FLOWJO (BD): programa de análisis de datos generados por cualquier citómetro de flujo. Ofrece un número de diferentes plataformas de análisis que le permiten realizar análisis más especializados.
- Software INFINICYT (BD): incluye herramientas que permiten el análisis, integración e interpretación de los resultados obtenidos, como diagramas basados en el análisis de componentes principales que proporcionen información sobre los marcadores más significativos para la separación e identificación de las poblaciones celulares a estudio, posibilidad de fusión e integración de varios ficheros en uno único analizable de forma global, posibilidad de crear imágenes de referencia.
TIPO DE TÉCNICAS UTILIZADAS
En nuestras instalaciones se realizar las siguientes técnicas.
- Cuantificación por citometria de flujo de perfiles inmunofenotípicos: Preparación de muestras biológicas para el estudio multicolor de inmunofenotipaje de poblaciones celulares. Se realiza con técnica de fluorescencia directa o indirecta mediante el uso de anticuerpos monoclonales unidos a fluorocromos para la caracterización de moléculas de superficie, intracelulares o nucleares que identifican el perfil fenotípico de poblaciones de interés.
- Separación celular con tecnología de fluorescencia. (FACS ARIA II) podemos aislar mediante fenotipaje multicolor poblaciones patológicas con una muy baja presencia en la muestra. Esta basados en las características ópticas del equipo y en su fluidica capaz de realizar la separación física por métodos electrostáticos de una población concreta de interés del conjunto de la suspensión celular.
- Separación celular con sistema de inmunomagnetico MACS: Sistema basado en columnas que se colocan dentro de un imán. Las células se etiquetan con microbeads para identificar los epitopos de interés en la superficie las células y quedan retenidas en la columna. Aquellas poblaciones que no se retienen constituyen la fracción negativa que contiene las células sin el ligando para el anticuerpo que se utilizó. Con ello conseguimos altos niveles de pureza. Este sistema automatizado mediante revestimiento de esferas de hierro sobre las células de interés permite su aislamiento, y produce un efecto mínimo sobre las mismas manteniendo altos niveles de viabilidad.
- Disgregación de tejidos: mediante sistemas de disociación mecánica, enzimática, o automatizado con un disgregador de tejidos Gentle MACS (Miltenyi Biotec) para la obtención de suspensiones celulares que pueden ser caracterizadas posteriormente con anticuerpos monoclonales para su cuantificación por citometria de flujo.
- Preparación de Cultivos celulares para diferentes procedimientos: estudios funcionales por citometria de flujo, estudios metabólicos (generación actividad REDOX), cuantificación de la expresión génica en células vivas mediante proteínas fluorescentes.
Células en cultivo para el estudio de micropartículas extracelulares y su implicación en los procesos patológicos como fuente de posibles dianas terapéuticas.
TIPO DE ENSAYOS
En el laboratorio de citometria de eflujo y separación celular se realizan entre otros los ensayos:
- Análisis multicolor de antígenos celulares de superficie e intracelulares.
- Ensayos de viabilidad celular: Screening de fármacos sobre líneas celulares. Identificación de diferentes estadios de muerte celular por apoptosis
- Análisis ciclo celular. Ensayos de Proliferación (CFSE)
- Estudios de señalización celular
- Estudios funcionales (resistencia a fármacos, ensayos cinéticos, estudios de permeabilidad celular, detección de la generación intracelular de especies oxigeno- reactivas ROS en líneas celulares y muestras de tejidos).
- Genes reporteros: análisis de eficiencia de expresión de proteínas fluorescentes.
- Separación celular por técnica de FACS o mediante aislamiento inmunomagnético
- Detección en sangre periférica de células circulantes tumorales (CTCs) y caracterización de expresión antigénica por marcaje multiparamétrico.
- Estudios de macropartículas extracelulares y/o exosomas mediante su cuantificación en módulo de célula pequeña y dispersión lateral de fluorescencia (SPD)
Muestras analizadas
En la Unidad de citometria procesamos y analizamos muestras biológicas procedentes de ensayos clínicos, pacientes, PBMCs aislados para estudios de investigación, cultivos celulares, disgregación de tejidos etc… para caracterización y/o aislamiento de poblaciones celulares de interés. Tenemos establecidas muestras control para la cuantificación de parámetros en cada uno de los procedimientos y/o protocolos de trabajo para cada usuario peticionario.
La petición se realizará rellenando el correspondiente formulario de solicitud, que estará disponible en la página web de la Unidad:
- Formulario solicitud Servicio de Análisis de datos
- Formulario solicitud Servicio de Citómetro de flujo
- Formulario solicitud Servicio de Separación Celular
Se tendrá en cuenta las condiciones de recepción de muestras por identificación de las mismas y las condiciones de presentación de las muestras valorando su estado de viabilidad.
Los datos proporcionados por el investigador para llevar a cabo un estudio analítico por citometria de flujo ha de ser:
- Diseño del experimento y número de muestras.
- Protocolo que desarrollar.
- Tipo celular que se desea analizar.
- Combinación de fluorocromos a utilizar en el experimento.
En el caso de solicitar una separación celular de sus muestras de interés los investigadores deberán aportar la siguiente información:
- Diseño del experimento.
- Protocolo que desarrollar.
- Tipo celular que se desea separar.
- Número de muestras a separar.
- Identificación de poblaciones celulares a separar: por emisión de fluorescencia de los fluorocromos utilizados (en el caso del separador FACSAria II) o por las beads inmunomagnéticas (cuando se trabaja con el separador AUTOMACS PRO).
- Concentración celular de la muestra a separar.
- Forma de recogida de las células separadas (tipo de tubo).
- Si existe o no necesidad de esterilidad Durante el procesado de las muestras.
En todos los equipos y en el laboratorio se mantienen los niveles de limpieza necesarios para la realización de los ensayos que requieren condiciones de esterilidad.
Los análisis de datos se establecen comparativamente entre muestras control y muestras de interés con programas de análisis estandarizados y de amplio consenso a nivel internacional.
TARIFAS UNIDAD DE CITOMETRIA DE FLUJO Y SEPARACION CELULAR
Tarifas Vigentes
PERSONAL Y UBICACIÓN
- Responsable Científica de la Unidad: Dra. Aránzazu García Grande
Tfno: 91 191 71 04 // 91 191 67 56
E-mail: citometria@idiphim.org - Personal técnico de laboratorio: Marta Garcia Gil
- Ubicación: 3ª planta del área de Investigación del Instituto de Investigación del Hospital Puerta de Hierro Majadahonda
RESERVA DEL SERVICIO INVESTIGADORES PUERTA DE HIERRO:
Para la utilización del servicio debe hacer una reserva previa en la web de la Unidad (requiere clave de usuario interno).
RESERVA DEL SERVICIO USUARIOS EXTERNOS:
Puede solicitar el servicio contactando previamente por email con la responsable de la Unidad.